你了解"Bt"吗?

引言

    苏云金芽孢杆菌(Bacillust huringiensis,Bt )属革兰氏阳性细菌，是目前世界上应用最广泛的微生物杀虫剂。苏云金杆菌的发现有上百年的历史:

1901年日本人石渡(Ishiwata)从病蚕尸体中分离出一株所谓碎倒细菌(sotto. bacteria)。

1911年Ernst Berliner在德国苏云金(Thuringia)的一个面粉厂的地中海粉斑螟(Anagasta Ruchniela)患病幼虫中又分离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌。

1915年定名为苏云金芽孢杆菌，一般称苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner)。Ernst Berliner指明苏云金杆菌含有伴胞晶体(parasporal Crystal)，但未曾说明苏云金杆菌的孢晶体有杀虫作用。

从1920年到1950年这一段时期内，有许多人曾用苏云金杆菌进行防治害虫的田间试验。

1956年Angus证实杀虫活性物质位于伴孢晶体之中。他将伴孢晶体与孢子分开之后，单独伴孢晶体仍然存在杀虫活性，证明了苏云金芽孢杆菌中的伴孢晶体蛋白是杀虫活性的主要来源。

       苏云金芽抱杆菌大多数菌株都能产生多种类型的伴抱晶体蛋白(parasporal crystal protein)，即δ一内毒素或杀虫晶体蛋白(InsecticidalC rystalP rotein, ICP)对鳞翅目(Lepidopera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleopter)、膜翅目(Hymenoptera)、同
翅目(Homoptera) 、直翅目(Orthoptera) 、食毛目(M allophaga)等多种昆虫，以及线虫、蜡类和原生动物等具有特异性的杀虫活性。迄今为止，已分离测定了100多个杀虫晶体蛋白基因序列, 目前Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛，最具潜力和应用前景的抗虫基因。

  图1,苏云金芽孢杆菌的革兰氏染色图

Bt 杀虫晶体蛋白的分类

       1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种晶体蛋白分为5群14亚类。其中具有溶血溶细胞作用的27kDa晶体蛋白基因被命名为cyt基因，其他只有杀虫活性的13亚类命名为狭义的晶体蛋白基因，即cry基因。cry基因可划分四群，即cryI 为鳞翅目特异性，cryⅡ为鳞翅目和双翅目特异性，cry Ⅲ为鞘翅目特异性，cryIV双翅目特异性。由于当时发现的基因数目少，彼此之间有明显的差异，因此各个基因的分类地位比较明确，从而使得Hofte和Whiteley的分类系统被广泛的接受和采用。

        近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原先分类系统中的氨基酸序列与杀虫活性间产生了不协调性，而且随着新基因的发现，这种分类方法越来越不能满足这两个条件，使得分类难以确定。Crickmore等在1995年国际无脊椎动物病理学会年会(SIP)上提出了以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一依据区别Bt基因的新分类系统，现已被各国广泛采纳。同源性在45%以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示;同源性在45%-78%之间，为第二等级，用大写英文字母表示;同源性在78%-95%之间，为第三等级，用小写英文字母表示;同源性在95%以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。只要满足来自Bt的伴抱包涵体(晶体)，与已知的cry或cyt具有高的同源性，就可以纳人这个系统。

        2004年1月已经发现299种杀虫晶体蛋白基因，分属于44群(其中cry基因42群，cyt基因2群),136模式基因。

杀虫晶体蛋白基因在Bt中的分布

   现在发现的116个杀虫蛋白基因，分别分布于Bt不同菌株中。不同血清型、不同亚种之间，其基因数和种类有明显差异，1-6个不等。同一菌株的杀虫晶体蛋白基因，也可能定位于不同的质粒上；或者多个晶体蛋白基因定位于同一质粒上；而有的则定位于染色体上"同一杀虫晶体蛋白基因在不同的菌株中可定位于不同的质粒上，即使在同一菌株中的同一杀虫晶体蛋白基因也可定位于不同的质粒上，甚至有的菌株的同一杀虫晶体蛋白基因可同时定位于质粒和染色体上。

     Bt质粒的多态性

      Bt菌中普遍有质粒存在，但不同菌株质粒的数量和大小各不相同，表明了Bt质粒的多态性"根据质粒的大小和特性，可将Bt质粒分为2种类型: Ⅰ型为小质粒，分子量小于15MDa，相互之间及与大质粒和染色体都无同源性，其功能不详；Ⅱ型为大质粒，分子量大于15MD，相互之间及与染色体间存在序列的同源性，在菌株间可通过接合方式转移，大多数杀虫晶体蛋白基因定位于这类质粒上。Bt不同亚种质粒数是不同的，并非任何一种质粒在所有亚种中都存在，不同亚种质粒数及大小不同，而且同一亚种不同来源的菌株，质粒数及大小也不一致，这充分反映了Bt质粒的多态性。

Bt核基因的多样性和保守性

       DNAG+Cmol%是细菌分类的重要指标之一，它反映了DNA链中不同类型的碱基的相对比例。一般细菌种内个体间DNAG+Cmol%的差异不超过3%，属内种间不超过10%；细菌群体内变化为24%-76%。Bt的G+Cmol%变化范围在35.7%-37%，表明Bt群体中不同菌株DNAG+Cmol%组成仍存在一定异，表现出其基因组CE.碱基组成的丰富多样性"同时，利用DNA-DNA分子杂交分析可有效分析其不同来源菌株DNA碱基顺序同源性，实验证明：Bt作为一个种DNA同源性达60%以上，表现出Bt基因组DNA的稳定性和保守性。