1、基因来源判断

通常90%以上的过敏反应是由8类食物引起的，这些食物包括：蛋、鱼、贝类、奶、花生、大豆、坚果和小麦^[3]。尽管食物中含有多种蛋白质，但只有数种蛋白质是过敏原，并且只有一部分人对其过敏。

首先应知道目的基因来自何种物种，是否属于这8类食物或160类不常见过敏性食物。如果基因来自这些物种，那么过敏原就有可能被转入GMO，因此要对基因的编码序列进行相似性比较，以确定其编码的蛋白质与已知过敏原是否相似。对此种来源的基因而言，如果序列分析显示该基因并不编码已知过敏原，还不能完全排除该基因产物不引起过敏，有可能是一种未被鉴定过的过敏原，或者其IgE结合部分与已知过敏原相似，仍可能引起过敏。因此要进一步做血清学试验。如果目的基因并非来源于已知的过敏性食物，同样要进行序列相似性比较，因为可能存在与已知过敏原类似的抗原决定簇。

2、序列相似性比较

目前已有198种主要过敏原包括食物过敏原的氨基酸序列是已知的。一般而言，显著的序列相似性要求至少有8个连续相同的氨基酸，促发过敏反应所要求的与T细胞结合的最短肽链长度为8个或9个氨基酸，与IgE结合的抗原决定簇所要求的肽链长度甚至更长。因此，检索8个连续相同的氨基酸顺序的分析方法应是比较可靠的，因为它分析的是整个蛋白质的序列，而不仅仅是与已知过敏原的已知抗原决定簇相似的氨基酸序列。

国际上对于转基因过敏性评估中序列相似性的比较目前采用与GenBank、EMBL、SwissProt、PIR等大型数据库进行初步比较。输入基因或蛋白质序列，通过BLAST或FASTA等程序搜索数据库，列出与输入序列有较高相似性的基因或蛋白质序列，然后再寻找其中有无已知过敏原序列。通常情况下，搜索程序给出的序列是非常多的，如何在众多列项中找到对评估有用的序列很是繁琐。而且，这种大而全的序列比对并没有考虑到过敏原与IgE结合的抗原决定簇氨基酸顺序，因而很可能出现假阳性或假阴性。如果目的基因编码的蛋白与某个已知过敏原有较高相似性，于是认为该目的基因可能编码过敏原，而实际上这段相似的序列并不是变应原决定簇，并不引起过敏。若把这种目的基因判断为有潜在的过敏性，则是不妥的。又如目的基因编码的蛋白与所有过敏原无较高的相似性，于是认为该目的基因不编码过敏原，而实际上目的基因上有一小段正好非常类似与某个过敏原的抗原决定簇，很可能产生过敏。在这种情况下若依据总体上序列相似性甚低，而做出不引起过敏性的判断，也是不对的。

倪挺等收集了目前已知的过敏原氨基酸序列以及已经研究清楚的过敏原决定簇，建立了一个食物过敏原数据库（http://ambl.lsc.pku.edu.cn），专门用于过敏性评估中的序列相似性比较。目前数据的储存采用文本形式，序列比较程序采用局部比对算法，用到了PHP、SQL、数据分割等计算机技术，计算机系统采用Windows 2000，服务器采用Apache HTTP Server。由于对已知过敏原进行了整理分类，同时考虑了过敏原决定簇的因素，该数据库提高了序列相似性分析的准确性。该数据库还包括模拟胃肠液消化试验，放射性变应原吸附抑制试验（RAST INHIBITION）等在过敏性评估中非常重要的试验方法。

目前序列相似性分析仅局限于氨基酸顺序的比较，由于除了氨基酸顺序决定簇之外还存在构象决定簇引起过敏，序列相似性分析并不能包括构象决定簇分析，因此在序列相似性分析之后，必要时应做血清学试验来验证目的基因编码的蛋白是否能与特定的IgE结合，从而更准确地判断转入的基因是否引起过敏。由于产生过敏主要取决于顺序决定簇，因此可以依据序列相似性分析作出初步判断。

虽然检索8个连续相同的氨基酸的这种分析方法是比较可靠的，但目前已确定的过敏原抗原决定簇的氨基酸序列资料还不十分充足，因此食物过敏原数据库序列比对往往采用分析整条肽链上氨基酸相似性的方法。然而这种方法找到的相似氨基酸顺序，也可能与IgE的结合毫不相干，同时它无法找到不连续的抗原决定簇或取决于蛋白质高级结构的构象抗原决定簇。这些不足一方面需要过敏原数据的不断增加，这也是专家强调研究重组过敏原的原因之一，另一方面也需要算法的不断改进。随着基因组学和蛋白质组学研究的发展以及人们对GMO食品的关注，关于过敏原特性的资料会很快丰富起来。着手研究、整理这方面的资料是十分必要的。我国的变态反应学专家强调一些过敏原对中国人群非常重要，如蒿属和葎草属以及屋尘螨的过敏原。鉴定出蒿属和葎草属的重要过敏原蛋白，并测定它们的氨基酸序列，将这些资料充实到数据库中是十分紧迫的事情。同时，克隆蒿属和葎草的重要过敏原对于第3部分提到的血清学试验也是很重要的。因此我们认为此项研究对于中国的转基因食品潜在过敏性评估是很有意义的，同时也向同国际接轨迈开了一大步。

3、血清学试验

在序列相似性比较之后，对于同已知过敏原有较高相似性或含有已知过敏原决定簇的目的蛋白需要进行血清学试验。由于对不同食物过敏的病人其血清中含有的特异IgE是不同的，因此检测目标蛋白是否为过敏原的血清需要由不同过敏病人的等量血清组合而成。免疫印迹反应是检测过敏原的一种常用方法，利用了过敏原与特异IgE的抗原抗体反应，通过电泳或ELISA即可检测。

放射性变应原吸附抑制试验（RAST INHIBITION）是检测过敏原的一种重要方法。其基本原理是：将包被有过敏原的CAP与血清反应，如血清中含有针对此种过敏原的特异性IgE(sIgE)，则可形成抗原-IgE-抗-IgE复合体，反应板洗涤后加底物，此复合物与底物作用产生荧光物质。sIgE的含量越高，荧光吸收值越高。RAST抑制试验是在上述RAST FEIA基础上加以改变而形成的。即先将一系列不同量的过敏原与相应过敏患者血清池血清孵育，再进行上述RAST FEIA步骤，由于抑制了血清中可能与CAP包被过敏原结合的一定数量的sIgE，荧光吸收值的最终结果将被降低。这里还要指出，通常RAST抑制试验是对过敏原总体抗原性的分析，它不能完全反映过敏原中单一组分的抗原性。这与血清中的IgE成分是否专一有关。RAST抑制试验的血清池必须由多个过敏病人的血清等量组成，病人越多越能准确反映过敏原总体的抗原性。通常血清池由至少5个过敏病人的血清等量组成。单独某一个过敏病人的血清不能构成血清池。在RAST抑制试验中做为标准的过敏原样品可以是过敏原提取液，也可以是原核表达过敏原。进行过敏性评估时抑制线斜率和50%抑制点是比较重点。抑制线平行或接近平行表明过敏原样本含相同或相近的过敏原组分。样本RAST抑制线间的斜率无显著差异时，可以进行50%抑制点的比较。过敏原的抗原性越强，其抑制作用也就越强，达到50%抑制所需要的过敏原的量也就越少。

对血清学试验中呈阳性的转基因食物应作出有蛋白质来源的标识。根据1996年国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所制定的过敏性分析程序，血清学试验中呈阴性的目的蛋白还应进行皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验，如果都为阴性，则说明转入的基因不可能引起过敏，可以进入市场。但在2001年联合国粮农组织和世界卫生组织专家建议的一个新的过敏性评估程序中，皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验被取消了，代之以动物模型试验，可能是考虑到人体试验的潜在危险。

    如果评估的新基因来自并无过敏历史的生物材料，由于不可能得到相应的来自过敏者的血清，因此需要将该蛋白质的氨基酸序列与己知的过敏原进行比较。若发现与某种过敏原类似，则可用对类似过敏原发生变态反应的病人血清进行免疫学试验。如果没有氨基酸序列的相似性，则应进行模拟胃肠液消化试验及加工过程的稳定性评价。如果其分子是易消化的或不稳定的，则此产品进入市场一般没有问题。然而，如果该分子在模拟的消化系统中和加工过程中是稳定的，则需要向有关监督管理机构咨询。

    在血清学试验中获得含特异IgE的血清非常重要。在1996年国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所制定的评估程序中对基因来源给予高度重视。如果一种基因来自一种常见的过敏性食物，则最理想的是必须用14种血清，用这14种血清免疫分析结果为阴性，则可>99.9%地保证供体的一种主要过敏原未转入GMO并且>95%地保证一种次要过敏原（影响至少20%敏感人群）未转入GMO。若基因来自一种不常见过敏性食物，则血清学试验必须用5种含特异IgE的血清。但此时更难找到对这些过敏原过敏的病人。用这5种血清免疫分析结果为阴性，则>95%地保证供体的一种主要过敏原未转入GMO。由于受不常见过敏原影响的人群比常见过敏原少，故此时对消费者的风险甚小。血清学试验若为阳性，则已充分证明此种转基因食品有过敏性。若转入的基因不来源于过敏性食品，也需要进行血清学试验。一般选用5种或更多的血清做免疫分析，如果结果阴性，则风险非常小，若所用血清少于5种，则需要进一步在标准化的条件下做胃酶、胰酶对该蛋白的消化试验。

    这里我们想强调的一点是血清种类的选取。选用何种血清是血清学试验的一个关键。一般来讲，有人对某种食品如贝类过敏，他的血清中含有对贝类特异的IgE，因此如果摄入某些贝类蛋白或结构相似的蛋白，就可能引起过敏。而如果血清学试验发现目标蛋白与他的血清没有免疫反应，则说明目标蛋白与贝类过敏原或其他结构相似的过敏原无关，对于这个人来说，此种转基因产品是安全的。但另外一个病人如果对花生过敏，那我们就要拿他的血清进行免疫学试验。因此，血清的选取应考虑到尽可能多的对不同食品过敏病人的血清。因此在经济合作发展组织（OECD）关于GMO过敏性评估的专家建议中，十分强调建立血清库的重要性。

    在中国，很重要的变应原来自屋尘螨和蒿属、葎草属，因此作为中国对转基因产品过敏性评估中非常有必要用对这些生物材料过敏的患者的血清做免疫学试验。我们认为用这些含特异IgE的血清进行潜在过敏性评估，对我国是有重要意义的。目前关于过敏原的DNA及蛋白质资料都来自国外的研究，其中关于蒿属和葎草属的资料十分贫乏，这两种过敏原的分子生物学资料亟待研究和积累。这是我们今后应当努力的方面。这里我们着重指出花粉过敏原和食物过敏原在免疫学实验中的交叉反应。对此交叉反应的解释是花粉与植物食物之间有共同的过敏原或者两者之间糖蛋白或凝集素的糖基与IgE的结合反应是同样的（即碳水化合物决定了它们的交叉反应）。

4、模拟胃肠液消化试验

一些学者认为，对于GMO中的非过敏性食物来源的基因，如果其编码的蛋白具有以下特点则可不考虑它们有潜在的过敏性：一是没有与己知食物过敏原相似的氨基酸序列；二是比较容易消化；三是与主要过敏原相比表达的量较少。因此，在氨基酸序列相似性比较之后目标蛋白能否在模拟肠胃液中迅速消化成为判断外源基因是否编码过敏原的重要指标。这一点已在许多国家提出的过敏性评估程序中被采纳。

模拟胃、肠液中蛋白酶、离子成分和pH值这三个要素应尽量符合人体胃肠中的情况。配制通常根据美国药典：在1000mL模拟胃液中，胃蛋白酶3.2g，NaCl 2.0g，HCl调pH值至1.2；在1000mL模拟肠液中，胰蛋白酶10.0g，磷酸二氢钾6.8g，NaOH调pH值至7.5+0.1。

将外源基因的原核表达产物或转基因食品的初提液进行模拟胃肠液消化试验，消化不同时间后与对照同时走SDS-PAGE，根据电泳结果判断原核表达产物或转基因食品中目标蛋白的半衰期，一般来说半衰期小于5分钟则认为容易消化。

5、动物模型试验

动物模型试验是2001年联合国粮农组织和世界卫生组织发布的一个专家建议的过敏性评估程序中提出的。在专家建议中试验用的动物应包括对不同重要过敏原起过敏反应的不同个体，并且每种具过敏反应的动物应有一定的样本量，这样得出的结果才可能是较为准确的。但对动物的试验是否可以完全代替对人的试验依然在讨论中，有人认为对动物的免疫试验可能与遗传性过敏的人情况完全不同，也不会产生人IgE反应的多样性。另外，试验用的原核表达蛋白有时会与转基因植物中表达的蛋白稍有不同，而这些不同可能导致不同的过敏性。有专家建议采用与人的反应比较近似的挪威棕色大鼠来建立试验模型。尽管存在困难，许多研究仍在继续，以期找到合适的动物模型能较好地模仿人的抗体反应甚至同过敏病人同样的临床反应。

6、皮肤穿刺试验和双盲法食物攻击试验

    虽然联合国粮农组织和世界卫生组织发布的新过敏性评估程序中取消了皮肤点刺试验和双盲法食物激发试验，但这两项试验依然是最能反映目标蛋白是否真的引起人过敏反应的最准确、最直观的方法。

皮肤点刺试验是临床上测定患者是否对目标食物过敏的一种普通而常用的方法。双盲法食物激发试验是目前食物过敏诊断的最准确的方法。出于对人体安全的考虑（而且不是在个别人中进行试验），联合国粮农组织和世界卫生组织在最新的评估程序中取消了这两项测定。

7、过敏原糖基化问题

研究发现一半以上的过敏原都是糖基化的。在植物过敏原中，一些重要的IgE结合的抗原决定簇被证明是糖基化的。比如，对大麦和小麦过敏病人血清中的特异IgE所识别的肽链C端含有一个糖基化的赖氨酸残基，该残基通过N-糖苷键与含有β1-2木糖和β-甘露糖核心结构的寡糖链相连，当去除寡糖结构后，该特异IgE就不能识别此段肽链。但是，糖基化并不是判断蛋白质是否为过敏原的常规标准，因为还有不少过敏原是没有糖基化的，比如一些属于lipocalin蛋白家族的动物过敏原就并不糖基化。此外，不少蛋白质的糖基化与过敏是没有关系的。糖基化对于IgE结合过敏原的反应有什么样的影响正在研究中。